2 курс / Гистология / Введение_в_иммуноцитохимию_Полак_Дж_,_Ван_Норден_С_

5. Иммуноферментные методы

31

Рис. 8. Срез мозга крысы, окрашенный с помощью ПАП-метода антитела­
ми к нейропептиду Y	(НП Y). Видны тело и дендриты взаимодействующей
с антителами клетки.	НП Y — предполагаемый нейропереносчик. Подготов­

ка ткани: мозг фиксировали путем перфузии 4%-ным раствором парафор­ мальдегида в ЗФ ФР, затем без замораживания нарезали на вибратоме. Флотирующие срезы толщиной 50 мкм окрашивали антителами без при­ крепления к твердой поверхности. Докрашивание не проводили.

антителами, поскольку они не являю тся анти-IgG. Д ля того чтобы ПАП -комплекс не связывался непосредственно с тк а ­ нью, достаточно провести блокирование нормальной сыворот­ кой, и фоновое окраш ивание будет минимальным. Метод мож ­ но использовать и на ультраструктурном уровне— при помощи электронной микроскопии связанный ПАП -комплекс легко отличить от неспецифически возникающих электроноплотных участков. При использовании методов с мостиками из анти­ тел конечный результат можно усилить последовательным повторением всех этапов процедуры (для сравнения различ­ ных методов с использованием мостиков из антител см. Огdronneau et al., 1981).

32 5. Иммуноферментные методы

Недостатки метода

Н едостаток ПАП -метода в том, что, во-первых, он требует дополнительных реагентов, а, во-вторых, процедура окраш и­ вания удлиняется.

Другие ферментные метки

Д ля конъюгирования с антителами применяют такж е щ е­ лочную фосфатазу. Этот фермент можно использовать и для электронной микроскопии с контрастированием солями свин­ ца. Д ля иммуногистохимии этот фермент не так удобен, как пероксидаза, поскольку его очень много в тканях. Щ елочную фосфатазу с успехом используют при работе методом ELISA (см. ниже) для количественного анализа, так как продукт реакции в этом случае можно сделать цветным и раствори­ мым, что позволит измерять его количество колориметриче­ ски. Этот фермент такж е с успехом используют при окраш и­ вании по двум антигенам одновременно, причем до недавнего времени его присоединяли к антителам не химически, а им­ мунологически.

Достоинство другой ферментной метки, глюкозооксида-

зы, — в том, что она отсутствует в животных тканях,	и нет
необходимости блокировать эндогенный фермент (см.	Suffin
et al., 1979).

6.ВАРИАНТЫ ОСНОВНЫХ МЕТОДОВ

6.1.Окрашивание по двум или нескольким антигенам одновременно

Во многих случаях			удобно при окраске среза выявлять
два или	несколько	антигенов одновременно. Д ля этого			перо-
ксидазу	проявляют	при	помощи разных субстратов	так,	что­
бы конечные продукты			реакции были окрашены по-разному
(N akane,	1968). После		проявления первого красителя, напри­
мер Д А Б, в тех точках			среза, где прошла реакция, накапли­
вается нерастворимый			коричневый продукт. Это	вещество

остается на срезе, в то время	как все остальные реагенты,
участвовавш ие в проявлении	(антитела и П АП -комплекс),

вместе с пероксидазной меткой смываются со среза кислым

буфером. Затем наносят вторые антитела			и повторяют всю
процедуру с другим субстратом,	например		4-хлор-1-нафтолом
(см. разд. П .7), дающим синий	продукт		(рис. 9).	Так, на
одном и том же срезе поджелудочной		ж елезы клетки, проду­
цирующие глюкагон, можно окрасить		в коричневый		цвет, ин­

сулин — в синий (фото 2). О краска может быть такж е крас­ ной или зеленой в зависимости от выбранного способа прояв­ ления.

Зеленое окраш ивание дает дигидрохлорид о-дианизидина

(Colm an et	al., 1976),	красное — З-амино-9-этилкарбазол (фо­
то 3) или	а-нафтол с	пиронином (N akane, 1968).

Антитела необходимо отмыть до начала второй реакции, так как пероксидаза, использованная в первой реакции, мо­ жет снова прореагировать в реакции проявления второго ан­ тигена, или, если оба препарата первых антител получены в животных одного вида, первые антитела № 2 могут связать­ ся со свободными антителами второго слоя первой реакции. Вот почему необходимо убедиться, что первый комплекс ан­ тиген — антитело полностью удален в результате кислотной промывки.

Один из недостатков этого метода состоит в том, что ан­ титела с высокой авидностью плохо диссоциируют даж е в сильной кислоте. В некоторых случаях эффективнее метод Траму (Tram u et al., 1978), поскольку он в большей степени обеспечивает сохранность антигенов ткани. В первой реак­ ции используют 4-хлор-1-нафтол, после проявления срез фо­ тографируют, затем разруш аю т комплекс антиген — антитело путем обработки среза подкисленным раствором пермангана-

34 6. Варианты основных методов

1.	Первый антиген ;	2.Первый комплекс антиген/антитело 3. Второй антиген;
	ПАП проявляют	отмывают, нерастворимый продукт	повторяют всю
	диаминобензидином	реакции остается в точках его	процедуру окраши-
		образования	вания,ПАП проявляют
			4-хлор-1-нафтолом
Рис. 9. Двойное иммунопероксидазное меченые с			помощью ПАП-метода
(по N akane).
та	калия, далее	продукт реакции с нафтолом растворяю т в

спирте. Повторное окраш ивание вторыми антителами, исполь­ зуемыми в первой реакции, должно давать отрицательный результат, так как этот комплекс должен быть отмыт полно­

стью. Д алее	проводят окраш ивание по		второму	антигену	и
снова фотографируют срез. Затем		фотографии		одних и	тех
ж е участков	среза сопоставляют.	Если	продукт	реакции	с

нафтолом не отмывали, то можно следить за распределением двух антигенов одновременно. Было высказано предположе­

ние, что при правильном подборе концентрации		антител м ож ­
но одновременно провести окраш ивание двумя		разными	пре­
паратами	антител, полученными в животных	одного и	того
ж е вида,	не отмывая продукты первой реакции	(S ternberger,
Joseph, 1979). Эта гипотеза получила подтверждение, но			все

ж е при окраш ивании по двум антигенам предпочтительно ис­ пользовать специфические (первые) антитела, несущие р аз­ ные метки (Valnes, B randtzaeg, 1982).

Другой метод, называемый двойным иммуноферментным, основан на использовании щелочной фосфатазы в качестве метки для одних антител и пероксидазы для других в соче­

тании	с приемом иммуноглобулинового мостика	(M ason, Sam ­
mons,	1978). В этом случае методы проявления не перекры ­
ваются, однако необходимы шесть препаратов		антител, два
из которых должны быть помечены разными		ферментными

6. Варианты основных методов 35

5.Нафтол AS—MX фосфат + быстрый голубой + ф (ЩФАЩФ)

4.Н26 2 + ДАБ + С

3.	ПАП кролика	3. ЩФАЩФ мыши
2.	Козьи антитела	2.Овечьи антитела

	к IgG кролика	к IgG мыши
	1. Кроличьи антите	1. Мышиные анти­
		тела к Х-цепям
	к к-цепям

Рис. 10. Окрашивание по двум антигенам двойным иммунопероксидазным методом с использованием антител к к- и A-цепям (Mason et al., 1983). Каждый слой состоит из двух реагентов. Ферменты проявляют раздельно. и-Цепи окрашиваются в коричневый цвет, ^-цепи — в синий.

метками. Н а всех стадиях, кроме проявления фермента, реактивы, используемые для выявления двух разных анти­

генов, смешиваются и		обе реакции идут	одновременно. П ро­
цедуру	окраш ивания	можно сократить,		если	использовать
кроличий ПАП -комплекс и мышиный			комплекс, состоящий
из щелочной фосфатазы мыши и антител				к ней	(Щ ФАЩ Ф )
(M ason	et al., 1983; рис. 10, цветное фото			4).
6.2. Методы с использованием меченого антигена
Ларссон и Ш варц		(L arsson, Schw artz,		1977)	разработали

новый метод окраш ивания с помощью антител, называемый радиоиммуноцитохимическим (РИ Ц Х ). В соответствии с этим методом радиоактивную метку (1251 ) присоединяют к антигену,

например гастрину, который затем взаимодействует с избыт­
ком антигастрина. Специфические антигастриновые антитела
оказываю тся, таким образом,	мечеными за счет присоединен­
ного антигена; при этом часть	антигенсвязывающих участков

остается свободной и может взаимодействовать			с	тканью .
Преимущество этого одностадийного метода в том,				что	при
последующем анализе	путем радиоавтографии		выявляю тся
только специфически	связавш иеся	антитела. К	недостаткам
этого метода можно отнести то, что,		во-первых,	каждый		пре-

36 6. Варианты основных методов

Меченный радиоактивным	Неспецифические и загрязняющие
золотом комплекс	антитела не содержат метку
антиген/антитело

Рис. 11. Метод меченого антигена.

Участки неспецифического	Загрязняющие
связывания блокированы	антитела выводятся
неиммунной сывороткой	из реакции при
	разведении
Рис. 12. Метод гаптенового сэндвича.
парат антител необходимо метить отдельно и, во-вторых, мето­

ды мечения и радиоавтографии сложны, а проявление заним а­

ет несколько дней. Разработаны	аналогичные методы с исполь­
зованием антигена, конъюгированного с ферментными		м етка­
ми (M ason, Sam m ons, 1979)	и золотом (Larsson,	1979)
(рис. 1 1 ).

6.3. Метод гаптенового сэндвича

Еще один остроумный метод, позволяющий избежать не­ специфического фонового окраш ивания, — это метод гаптено­ вого сэндвича с использованием мостика из моноклональных антигаптеновых антител (Jasani et al., 1981). П реж де всего, участки неспецифического связывания блокируют неиммун­ ной сывороткой животного, донора первых антител. Следую ­

щий слой — первые антитела,		меченные гаптеном (маленькая
молекула-антиген,	например	имидоэфир динитрофенил амино-
проприонитрила),	затем добавляю т моноклональные антитела
к гаптену и далее	связанный с гаптеном ПАП -комплекс из

6. Варианты основных методов

37

Рис. 13. Комплекс белок А — золото, взаимодействующий с Fe-частью мо­ лекулы первых антител.

любого вида, который выявляю т при помощи пероксидазной реакции. Окраш иваются только участки ткани, содержащ ие антиген, узнаваемый первыми антителами (рис. 12).

6.4. Мечение при помощи золота

Недавно было разработано несколько методов, основан­ ных на использовании в качестве метки частиц коллоидного золота. Частицы золота легко идентифицировать при элект­ ронной микроскопии, вот почему применение этих методов началось именно в электронной микроскопии (Faulk, Taylor, 1971), хотя на световом уровне их использование такж е воз­ можно. В основе одного из методов (Roth et al., 1978) лежит способность белка А из бактерии Staphylococcus aureus свя­ зываться с F c-участком молекулы иммуноглобулинов и части­ цами коллоидного золота. Комплекс белок А — золото служит вторым слоем при окраш ивании, и на электронно-микроско­ пическом уровне связанные частицы золота обнаруживаю тся только в точках взаимодействия белка А с иммуноглобули­ нами первого слоя антител (рис. 13).

Этот простой метод находит все более широкое примене­ ние в иммуноцитохимии на ультраструктурном уровне. Недо­ статок его в том, что на срезе выявляются все присутствую­ щие иммуноглобулины, и стадию блокирования нормальной сывороткой приходится опускать. Белок А такж е соединяют

спероксидазой и ферритином.

Внекоторых случаях используют метод выявления анти­

гена путем мечения его золотом	(Larsson, 1979)	по аналогии
с радиоиммуноцитохимическим	методом (см. рис.	11). Ч асти­

цами золота метят и антитела второго слоя при непрямом

окрашивании (Rom ano	et al., 1974; H orisberger, 1979;	De Mey
et al., 1981, 1983; рис.	14— 16).
Одно из достоинств методов, основанных на применении в
качестве метки частиц	золота, состоит в том, что комплексы,
содержащ ие эти частицы, окрашены в интенсивный		красный

38 6. Варианты основных методов

Повышение интенсивности	Повышение интенсивности
окрашивания за счет	окрашивания за счет
повторения процедуры	осадка серебра

Рис. 14. Антитела, меченные золотом, — непрямой метод.

цвет и хорошо видны в световой микроскоп. При этом, вопервых, можно проверить реакционную способность антител и ткани при помощи световой микроскопии, не прибегая сразу к электронной, и, во-вторых, золото можно использовать для двойного окраш ивания в сочетании с пероксидазой, которую проявляют 4-хлор-1-нафтолом или диаминобензидином; ко­ нечные продукты реакции при этом окрашены соответственно в синий или коричневый цвет (Gu et al., 1981). Чувствитель­ ность метода сильно повышается при восстановлении частиц золота лактатом серебра с образованием интенсивно черного

продукта	(H olgate et al., 1983, b;	рис. 14).
М ожно	приготовить препараты	коллоидного золота, раз­

личающиеся по диаметру частиц от 5 до 30 нм, и проводить окраш ивание одновременно по нескольким антигенам с после­ дующим анализом на электронно-микроскопическом уровне. Д ля этого проще всего прямо пометить антитела первого слоя частицами золота разного диаметра (рис. 17). При нанесений такой смеси меченых антител на срез двенадцатиперстной кишки на одном препарате удается продемонстрировать при­ сутствие в клетках различных гормонов, таких, как холецистокинин, гастроинтестинальный пептид и секретин, поскольку каждый из этих гормонов связывается с частицами опреде­

ленного диаметра. М ожно рекомендовать	такж е непрямой
метод — двойное или тройное окрашивание,	проводимые по­

следовательно или параллельно, при помощи антител, не даю ­ щих перекреста (рис. 17), как это делаю т в случае использо­

вания	двойного иммуноферментного метода.	Иногда
даж е	удается покрасить две стороны одной и той	же элек­

тронно-микроскопической сеточки разными препаратами ан­ тител, отличающимися по диаметру частиц золота, связанных

6. Варианты основных методов

39

0?8

Рис. 15. Микрофотография среза толстого кишечника человека. Видны сек­ реторные гранулы в клетке, продуцирующей энтероглюкагон, окрашенные при помощи непрямого метода с использованием кроличьих антител к глюкагону и меченных частицами золота диаметром 20 нм козьих антител к

IgG кролика. Обратите внимание на то, что частицы золота скоцентриро-
ваны в области секреторных гранул. Подготовка ткани: ткань фиксировали
2,5%-ным	формальдегидом, постфиксацию осмием не проводили, заливали
в аралдит	и окрашивали ультратонкие срезы на электронно-микроскопиче­

ских сеточках	с докрашиванием	уранилацетатом и нитратом свинца. М —
митохондрион;	БМ — базальная	мембрана.
с антителами (B endayan,		1982). Наконец, с помощью этого

метода можно обнаружить в данной грануле или органелле присутствие более чем одного антигена, способного реагиро­

вать с антителами (R avazzola, Orci,	1980;	V arndell	et	al.,
1982).
Успех при использовании данных	методов,	так ж е	как	и

методов, основанных на применении пероксидазы или флуо­ ресцентных красителей, зависит от правильного проведения фиксации и демаскировки тканевого антигена. При соблюде­ нии всех условий, при правильной подготовке препарата тка­ ни методы с применением частиц коллоидного золота могут оказаться эффективнее, чем пероксидазный метод и сравне­ ние полутонких-тонких срезов на электронно-микроскопичес­ ком уровне.

40 6. Варианты основных методов

Рис. 16. Микрофотография среза нормального Т-лимфоцита крови человека. Клеточную мембрану окрашивали при помощи моноклональных антител ОКТ-4 и меченных частицами золота диаметром 20 нм кроличьих антител к IgG мыши. Положительная реакция с ОКТ-4 указывает на принадлеж­ ность клетки к подгруппе Т-хэлперов. Подготовка ткани: с антителами ин­ кубировали нефиксированные клетки; после окрашивания проводили фик­ сацию 3%-ным формальдегидом, затем тетраокисью осмия и заливали в аралдит. Ультратонкие срезы докрашивали уранилацетатом и цитратом свинца. Микрофотография была любезно предоставлена д-ром Д. Катовски, отделение лейкемий, госпиталь Хаммерсмит, Лондон.

6.5. Авидин-биотиновые методы

Новый перспективный метод мечения основан на исполь­ зовании биотина и авидина. Он позволяет повысить чувст­ вительность, не прибегая к ПАП -комплексу, получение кото­ рого — очень трудоемкая процедура. Авидин — большой гли­ копротеин, выделяемый из яичного белка и имеющий очень высокое сродство (4 участка связывания) к биотину, низко­ молекулярному витамину, присутствующему в яичном ж елт­ ке. Биотин можно присоединить к молекуле антител или к пероксидазе. Авидин такж е можно пометить, скажем, пероксидазой или флуоресцеином. Все эти реагенты используют-